中國科學院分子細胞科學卓越創新中心周斌研究組與香港中文大學呂愛蘭研究組合作，構建了雙同源重組酶系統，建立了體內神經中胚層祖細胞（NMPs）的譜系示蹤與功能研究技術，并結合單細胞轉錄組測序技術，揭示了NMPs在胚胎發育中的細胞命運和分子特征。這一研究揭示了NMPs在胚胎發育中的分布、分化潛能和功能，為脊髓損傷的細胞治療提供了新的研究方向。
脊髓作為中樞神經系統的重要組成部分，承擔著神經信號傳導和肌肉運動協調等關鍵功能。目前，針對脊索退行性病變和外源性脊髓損傷的治療手段存在局限性。體外細胞實驗表明，NMPs能夠分化為脊髓中的神經細胞，并可以產生周圍的中胚層組織，在脊髓損傷的細胞治療中具有應用前景。盡管既往研究證實NMPs具有雙向分化潛能，但缺乏在體內直接示蹤和功能評估的遺傳工具。因此，開發精準靶向體內NMPs的技術對揭示其細胞命運和功能至關重要。
該研究設計和構建了多種雙同源重組酶系統，建立了哺乳動物體內特異性標記NMPs的遺傳譜系示蹤新技術。研究發現，NMPs具有雙向分化潛能，能夠同時生成神經細胞和中胚層細胞。同時，研究通過特異性清除NMPs實驗，發現NMPs減少導致胚胎軀干和尾部發育異常，證實了NMPs在胚胎發育中的關鍵作用。
研究對小鼠胚胎期8.5天的尾端組織進行單細胞測序。研究通過分析將細胞主要分為14個不同的簇，如NMPs、Neural tube、Somite和Presomitic mesoderm等。進一步，分析發現，NMPs特異性表達Brachyury（T）和Sox2，并高表達Nkx1-2、Epha5、Fgf17和Fgf8等分子標志基因。研究還揭示NMPs的分化受到Wnt、FGF和BMP等信號通路的調控：Wnt和FGF信號通路促進NMPs向中胚層分化，而BMP信號通路則通過抑制Sox2的表達推動NMPs向中胚層命運轉變；相反地，視黃酸信號通路通過抑制Wnt信號促進NMPs向神經命運分化。
為精準示蹤NMPs，研究利用Dre-rox和Cre-loxP兩套同源重組系統，分別構建T-DreER和Sox2-CreER基因敲入遺傳工具小鼠，來分別標記T來源和Sox2來源的細胞。研究設計了兩套遺傳策略來特異性標記示蹤體內NMPs。在第一套策略中，研究使用Rosa26-traffic light reporter系統。研究顯示，通過Tamoxifen誘導，可在T-DreER、Sox2-CreER、R26-TLR小鼠體內同時分別標記T+細胞、Sox2+細胞和T+Sox2+雙陽性細胞。這一方法實現了在單個胚胎中同時追蹤T+、Sox2+和T+Sox2+三群細胞。為更清晰直觀地標記NMPs，探究NMPs的細胞定位、細胞運動和分化的細胞類型，研究開發設計了第二套策略即R26-RL-GFP系統。在T-DreER、Sox2-CreER、R26-RL-GFP三基因小鼠中，只有Dre-rox和Cre-loxP雙重重組的情況下才可以激活GFP表達，從而特異性地標記T+Sox2+的NMPs。通過這兩套雙重組酶介導的遺傳標記系統，研究追蹤了NMPs在胚胎發育過程中的時空分布，發現了這些細胞主要定位于胚胎的尾部區域并參與神經管、軸旁中胚層和部分內胚層組織的形成。
為探討單個NMP是否具有雙向分化潛能，研究利用R26-confetti2報告系統進行單細胞克隆分析。通過低劑量Tamoxifen誘導，研究在E8.5標記了單個NMP。進一步，結果顯示，單個NMP能夠分化為神經細胞克隆、中胚層細胞克隆或同時生成兩種細胞類型的混合克隆，這證實了NMPs在體內的雙向分化潛能。研究還發現，少數NMPs能夠分化為內胚層細胞，這擴展了NMPs在胚胎發育中的已知貢獻，揭示了其在多胚層組織形成中的潛在作用。
進一步，為闡明NMPs在胚胎發育中的功能，研究開發了T-DreER、Sox2-CreER、R26-LR-DTR小鼠模型，通過雙重組酶介導白喉毒素受體的表達，特異性清除NMPs。實驗結果顯示，NMPs清除導致胚胎軀干和尾部發育異常，表現為尾部縮短和軀干結構畸形，這證明了NMPs在胚胎發育中的關鍵作用。研究還發現，NMPs的清除時間點對其功能影響顯著。E8.5清除NMPs僅導致輕微的尾部發育缺陷，而E10.5清除則引發嚴重的軀干和尾部發育異常，這或與胚胎發育過程中其他細胞群體的代償作用有關。
上述研究通過開發新型遺傳工具，在體內實現了對NMPs的特異性遺傳標記、示蹤和功能評估。這一研究深化了科研人員對NMPs在胚胎發育中作用機制的認知，為疾病建模、藥物研發與細胞治療等的發展奠定了基礎。
4月3日，相關研究成果以Dual genetic tracing demonstrates the heterogeneous differentiation and function of neuromesodermal progenitors?in vivo為題，在線發表在《美國國家科學院院刊》（PNAS）上。研究工作得到國家自然科學基金委員會、科學技術部、中國科學院、上海市科學技術委員會、香港研究資助局等的支持。
論文鏈接
示蹤的NMPs在胚胎E8.5和E10.5的時空分布
本文鏈接：研究建立神經中胚層祖細胞的譜系示蹤與功能研究技術http://www.sq15.cn/show-12-971-0.html
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