傳統觀念中，無脊椎動物外骨骼常被視為“無生命的石頭”；脊椎動物骨骼因其骨髓具有終身造血功能，被視為“活的器官”，成為脊椎動物特有的重要演化創新。這一觀點常被作為經典認知和典型案例，出現在教科書中。
然而，中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室、方宗熙海洋生物進化與發育研究中心、中國工程院院士包振民和王師教授團隊，歷經9年在動物骨骼造血研究領域取得的最新突破性發現，卻顛覆了這一觀點。
近日，這項創新性成果發表在國際權威學術期刊《科學進展》上。論文發表后，便第一時間被該期刊選為網站主頁的三篇亮點文章之一，并被《科學》的宣傳媒體ScienceAdviser予以重點推介。
“該研究在國際上首次揭示了無脊椎動物骨骼中普遍存在造血干細胞巢，解開了5億多年前的貝殼生命奧秘，顛覆了骨骼造血為脊椎動物特有演化創新的傳統觀念，它為理解動物造血系統起源演化提供了全新視角，也為海洋生物干細胞研究開辟了新方向和新范式。”海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室主任王師對《中國科學報》說。
王師（左三）與部分團隊成員在實驗室研討 金松攝
從一次實驗“意外”到顛覆性發現
軟體動物（俗稱貝類）是海洋中最大的動物門類，也是寒武紀早期起源的主要礦化骨骼代表性動物類群之一。研究發現，貝殼呈現出諸多令人費解的生物學特性，與脊椎動物骨骼存在驚人的關聯性，卻始終難以用傳統認知合理解釋。
寒武紀為何是有殼類生物的大爆發？貝殼是否可能蘊藏著未被認知的生命奧秘，是否為普遍認知中沒有生命的“石頭”？驚人現象背后存在怎樣的生物學機制？……這些生物學界的未解之謎，成為生命演化史上的“懸案”。
然而，科學研究就是這么奇妙，實驗中的一次意外，極有可能會成為通往自由王國的一扇門，進而開辟科學新境界。
“誰會想到，我們團隊這項研究的肇端，竟是9年前的一次實驗中的意外發現。”王師說。
2016年，團隊在嘗試對新鮮貝殼進行核酸提取的過程中，遇到一個匪夷所思的現象：樣本中不僅檢測到DNA，還意外發現活細胞的指示物——RNA分子。由于RNA分子極不穩定，在活細胞外會快速降解，再加上過去貝殼一直被認為是“無生命的石頭”，不該有RNA殘留。因此，團隊最初認為是貝殼內表面的軟體組織未清理干凈樣本受到污染所致。但在多次對貝殼樣本進行徹底清理后，仍能檢測到RNA分子的存在。這一“意外”現象讓團隊意識到：貝殼里可能存在活細胞！
“這意味著過去被認為是‘無生命的石頭’的貝殼，實際上是一個活的器官。”回想起當時的情景，王師仍興奮不已，“這是學界觀念的顛覆性更新。這也意味著我們找到了破解這起5億多年前‘懸案’的關鍵突破口。”
王師（右一）召開團隊組會 金松攝
不斷地發現問題，解決問題
深夜時分，位于中國海洋大學浮山校區的方宗熙海洋生物進化與發育研究中心實驗室，燈火通明。師生們埋首實驗臺前，忙著自己的工作。實驗室靜悄悄的，只聽見儀器工作時發出的輕微“嗡嗡”聲。
“已經記不清多少個日日夜夜，我們團隊師生通宵鏖戰了。”該研究主要完成人、中國海洋大學副教授連姍姍說，“科研攻關的過程，其實就是不斷發現問題、分析問題和解決問題的過程。”
要證實貝殼里存在活細胞，團隊面臨的第一個難題就是從堅硬的貝殼中穩定、有效地提取RNA。由于傳統軟組織研磨方式并不適用，就只能先將貝殼在液氮中速凍后，再在研缽中手動研磨成粉。這是要進行RNA提取實驗的先決條件，也是一項耗時費力的體力活。
團隊成員、博士研究生胡乃娜和碩士生劉思諾兩人，最開始常常要連續幾天在實驗室重復這一工作，后來團隊引入研磨儀才解放出來。
“磨一上午手就起泡了，而且效率比較低，做一次RNA提取實驗往往要耗費幾天時間來作準備。”胡乃娜說，這也說明，做科研不光要有扎實的學術素養，還需要有埋頭苦干的韌勁。
解決了穩定提取RNA的問題后，對貝殼內細胞進行直接觀察成為新的挑戰。這需要對高度鈣化的貝殼進行脫鈣處理。然而針對貝殼優化的脫鈣液配方并無現成方案，需要團隊自行摸索。
為此，團隊花了近半年時間，嘗試去除貝殼表面堅硬的碳酸鈣層，暴露內部的有機質層。這項工作完成后，團隊又開始反復優化固定和染色方法，以便在顯微鏡下觀察細胞分布。
“最初染色效果很不理想，在進行了若干次嘗試后，我們最終選擇了邊脫鈣邊固定的方式，盡可能保持細胞的完整形態。”連姍姍說，團隊最后成功脫除了貝殼的部分鈣質層，并通過染色清晰地觀察到了細胞的存在和分布。
貝殼內的確存在活細胞。新的問題又來了：這些活細胞屬于什么類型、又有什么功能？這成為團隊接下來亟待攻克的又一關鍵難題。
單細胞測序技術的發展給團隊提供了很大幫助，但提出了更大的挑戰。
“該實驗的關鍵難點在于，單細胞測序技術通常要求對活細胞進行分析。解決這一問題就耗費了團隊近一年時間。”連姍姍說，后來團隊摸索出了相對直接的方法，一是分析貝殼內偏好表達的膠原類型；二是短時間內將貝殼物理破碎成小塊，這樣能顯著加快脫鈣速度。“這一過程非常考驗實驗者的流暢度，必須在最短時間內完成上述操作，以確保細胞的活性。任何一步出現問題，就得從頭再來”。實驗室的實驗臺上留有大量坑洼的小洞，這都是前期實驗留下來的。
團隊最終成功建立了適用于無脊椎動物外骨骼的干細胞研究體系，并通過多組學遺傳解析、細胞體外培養和誘導分化、活體動物細胞示蹤和功能驗證等系統性證據層面揭示了貝殼內存在造血干細胞巢，并取得原創性發現、提出新學說：
貝殼內存在高豐度的造血干細胞，比例高達40%-60%；貝殼造血譜系展現出諸多與脊椎動物相似的生物學特征；貝類造血干細胞除具有造血功能，同時具有生物礦化功能；動物界主要類群的礦化骨骼中均具有潛在的造血干細胞巢，揭示動物祖先造血干細胞核心調控基因集，提出“骨骼干細胞巢的重大演化創新為寒武紀動物大爆發的重要驅動力”的新理論學說。
王師（中）與團隊部分成員合影 金松攝
長久的熱愛與堅守才能走得更長遠
“‘無脊椎動物骨骼內普遍存在造血干細胞巢’的原創性發現，為迄今國際上首次發現存在跨動物界保守的普適性干細胞巢，是生命科學領域的重要認知突破，顛覆了骨骼造血為脊椎動物特有演化創新的傳統觀念，解答了長期困擾學術界的無脊椎動物造血干細胞來源之謎……”
論文發表后，被《科學進展》選為網站主頁的三篇亮點文章之一，并被《科學》的宣傳媒體ScienceAdviser予以重點推薦介紹。國內生命科學及醫學領域權威學術微信公眾號“BioArt”也報道了這一成果，并給予高度評價。面對成功，王師還是一如既往的低調內斂：“這歸功于團隊全體成員的齊心協力與不懈奮斗。”
“做科研要學會堅持、堅守和堅定。科研之路充滿了未知和挑戰，一定要堅持，堅持到底就是勝利；科研從來不會一蹴而就，要堅守做人底線和學術道德底線；要堅定信念，有不破樓蘭終不還的精神。”成果發表之后，在一次團隊組會上，連姍姍暢談了自己的“通關感言”，這也是她從事科研的深切體會。
胡乃娜2016年進入實驗室，她笑稱9年多來自己與項目在一起“共生”。她回憶起項目攻關期間的一件小事，讓她至今難以忘懷。有段時間中心公共平臺的共聚焦顯微鏡預約極其緊張，經常排到深夜或凌晨時段。有一次沒預約到顯微鏡，她凌晨四點多趕到實驗室“撿漏”，卻發現一位認識的師兄還在顯微鏡前工作。胡乃娜就走上前，結果一句“師兄”把人家從沉浸中硬生生拉回現實，嚇得從凳子上彈了起來，兩人一時間笑得前俯后仰。
“長達一兩年的時間里，我經常處于反復嘗試卻難以獲得理想結果的循環中，這是對我的耐心和堅持的巨大考驗。所幸，我堅持了下來。”胡乃娜感慨地說，“我知道周圍不少同學和我一樣，深夜還堅守在顯微鏡前，心無旁騖地鉆研。這都是基于對科學的熱愛。”
在團隊成員、博士研究生陳曉妹看來，王師老師和團隊其他老師的堅定信念和樂觀態度是取得成功的一個關鍵因素。“當研究暫時陷入迷茫和困頓，老師們就會不斷鼓勵我們嘗試新路徑，尋找新思路，引領我們克服困難、深入探索并最終成功完成關鍵功能實驗。”她說。
科研永無止境，創新一刻不停。在王師和團隊成員們看來，未來還有很多事情要做，需要不斷完善、不斷創新、不斷前進。
目前，團隊已啟動“探殼計劃”（DeepShell Project），將研究目標從最初9個物種擴展到近50個，涵蓋整個動物界的主要動物骨骼類群和完整進化鏈條，以期重塑對無脊椎動物造血系統的認知，為理解動物造血與礦化骨骼的宏觀演化提供全新理論框架。
“我們想以更為宏觀的研究視角確認這一發現的普遍性，更想探索無脊椎動物類群骨骼干細胞高豐度的維持機制，為人類再生醫學領域干細胞研究或治療策略研發提供重要啟示。”夢想就在前方，王師和團隊信心滿懷。
相關論文信息：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adw0958
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