活細(xì)胞DNA成像是指利用成像手段，對活細(xì)胞內(nèi)的DNA序列進(jìn)行標(biāo)記和觀察。活細(xì)胞DNA成像常用于檢測基因組DNA在細(xì)胞核內(nèi)的定位分布和動態(tài)變化等特征，幫助人們了解這些特征與基因表達(dá)調(diào)控之間的關(guān)系，加深人們在基因組層面對細(xì)胞生命活動的認(rèn)識。在醫(yī)療領(lǐng)域，活細(xì)胞DNA成像可以用來檢測細(xì)胞內(nèi)基因組DNA的拷貝數(shù)，有助于21-三體綜合征等染色體異常相關(guān)疾病的診斷。
日前，中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心研究員陳玲玲團(tuán)隊開發(fā)了一種活細(xì)胞DNA成像新工具。團(tuán)隊篩選并優(yōu)化了現(xiàn)有的基因編輯系統(tǒng)CRISPR-dCas12a，并基于此構(gòu)建了新型DNA成像系統(tǒng)CRISPRdelight。這一新工具可用于活細(xì)胞內(nèi)非重復(fù)DNA序列成像，為研究活細(xì)胞中DNA位點的空間位置和動力學(xué)特征提供了更加簡單便利的手段。相關(guān)研究論文在線發(fā)表于《自然·方法》雜志。
已有工具存在明顯局限
隨著能夠特異性靶向任意核酸序列的基因編輯系統(tǒng)CRISPR-Cas被開發(fā)出來，基于該系統(tǒng)的活細(xì)胞DNA成像工具也在不斷迭代更新。
“當(dāng)前，活細(xì)胞DNA成像工具的種類已經(jīng)十分豐富。”論文第一作者、中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心博士楊良中介紹，其中大部分工具都是從CRISPR/dCas9-EGFP（EGPF是一種熒光蛋白質(zhì)）系統(tǒng)衍生而來。這些已有的活細(xì)胞DNA成像工具分別從向?qū)NA的骨架結(jié)構(gòu)和表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建方式等方面，對原始系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化升級。
例如上海科技大學(xué)研究員馬涵慧開發(fā)了DNA成像系統(tǒng)CRISPRainbow和CRISPR-Sirius，用于在活細(xì)胞中觀察基因組的三維結(jié)構(gòu)，并示蹤它們的動態(tài)變化。前者創(chuàng)造性地在向?qū)NA骨架結(jié)構(gòu)中引入了RNA適配體，用于標(biāo)記DNA序列，并通過改變RNA適配體的類別，實現(xiàn)了不同DNA靶點的多色成像。后者則在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步做了優(yōu)化，通過增加RNA適配體的數(shù)目來提高成像質(zhì)量。北京大學(xué)教授陳匡時團(tuán)隊開發(fā)的兩種DNA成像系統(tǒng)，則通過引入分子信標(biāo)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像方法來提高DNA成像信噪比，以提升成像清晰度。
“目前較為成熟的系統(tǒng)已經(jīng)實現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)絕大部分重復(fù)DNA序列成像和多色成像，甚至在一定程度上實現(xiàn)了非重復(fù)DNA序列成像，但它們都存在明顯的局限性。”楊良中舉例說，比如一些系統(tǒng)，通過改進(jìn)向?qū)NA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方式，將多條向?qū)NA表達(dá)元件放到同一個質(zhì)粒上，從而減少需要向細(xì)胞內(nèi)遞送質(zhì)粒的數(shù)目，增強(qiáng)成像效果。但將多個表達(dá)元件構(gòu)建到一個質(zhì)粒的方法步驟繁多、操作復(fù)雜，并不利于推廣使用。還有一些系統(tǒng)，通過將DNA的標(biāo)記信號放大，實現(xiàn)一條向?qū)NA對目的序列的標(biāo)記和成像。但僅利用一條向?qū)NA可能會存在標(biāo)記脫靶的問題。
總而言之，在基于CRISPR/dCas9-EGFP的活細(xì)胞DNA成像工具中，利用一條向?qū)NA標(biāo)記DNA往往信號太弱或容易脫靶，要實現(xiàn)特異性非重復(fù)DNA序列成像或多色成像，需要表達(dá)多條向?qū)NA，通過多個靶點DNA信號的富集作用，才能實現(xiàn)對目的非重復(fù)序列成像。而如果讓每個表達(dá)元件只表達(dá)一條向?qū)NA，就會增加向?qū)NA表達(dá)元件的數(shù)量，提高成像的復(fù)雜度，降低成像效率。“如何高效率、高質(zhì)量實現(xiàn)非重復(fù)DNA序列成像，一直是活細(xì)胞DNA成像領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。” 楊良中說。
新型系統(tǒng)更加簡便高效
與基于CRISPR/dCas9-EGFP的活細(xì)胞DNA成像工具不同，此次團(tuán)隊開發(fā)的新工具是基于基因編輯系統(tǒng)CRISPR-dCas12a。這兩種系統(tǒng)都可以特異性靶向DNA，但CRISPR-dCas12a還能夠加工處理系統(tǒng)本身的CRISPR陣列，并生成成熟的向?qū)NA。
“我們開發(fā)的新型DNA成像系統(tǒng)CRISPRdelight正是利用了這一特點，通過表達(dá)一條能編碼多條向?qū)NA的轉(zhuǎn)錄本（即CRISPR陣列）來進(jìn)行成像，而非單獨(dú)轉(zhuǎn)錄每條向?qū)NA。”楊良中介紹，這樣既實現(xiàn)了對靶點DNA信號的富集放大，又避免了系統(tǒng)復(fù)雜度增加。而且這一條轉(zhuǎn)錄本不僅可以編碼靶向同一DNA位點的向?qū)NA，也可以同時編碼靶向不同位點的向?qū)NA，實現(xiàn)多位點多色成像。因此，新系統(tǒng)更加簡便高效，容易通過增加向?qū)NA的數(shù)目提高成像質(zhì)量，大大降低了活細(xì)胞中非重復(fù)序列DNA成像的門檻。
與此同時，團(tuán)隊利用新系統(tǒng)揭示了基因位點在細(xì)胞核內(nèi)的定位與其運(yùn)動能力和轉(zhuǎn)錄活性的相關(guān)性，還實現(xiàn)了對4種活細(xì)胞內(nèi)衛(wèi)星DNA的多位點多色成像。
由于新系統(tǒng)具有簡便易操作等特點，楊良中認(rèn)為，該系統(tǒng)未來有望應(yīng)用于需要進(jìn)行活細(xì)胞DNA成像的實驗室，為活細(xì)胞中基因組DNA轉(zhuǎn)錄活性、DNA在細(xì)胞核內(nèi)的定位分布和動態(tài)變化特征之間的關(guān)聯(lián)性，以及等位基因之間表達(dá)調(diào)控的異質(zhì)性等研究提供助力，還能進(jìn)一步幫助研究人員了解三維基因組在細(xì)胞核內(nèi)高度組織化的分子機(jī)制及其功能意義等。
非重復(fù)DNA序列成像和多位點多色成像是活細(xì)胞DNA成像長期面臨的兩大難題。如今，新系統(tǒng)的出現(xiàn)基本解決了非重復(fù)DNA序列成像的問題，但在活細(xì)胞DNA多位點多色成像方面，新系統(tǒng)仍有改進(jìn)空間。“盡管我們通過在新系統(tǒng)中引入RNA適配體實現(xiàn)了多個重復(fù)DNA序列的多位點多色成像，但是RNA適配體的引入在一定程度上影響了系統(tǒng)對CRISPR陣列的加工能力。”楊良中說，要實現(xiàn)多個非重復(fù)DNA序列的標(biāo)記追蹤，未來還需進(jìn)一步對CRISPRdelight進(jìn)行優(yōu)化。
活細(xì)胞DNA成像是指利用成像手段，對活細(xì)胞內(nèi)的DNA序列進(jìn)行標(biāo)記和觀察。活細(xì)胞DNA成像常用于檢測基因組DNA在細(xì)胞核內(nèi)的定位分布和動態(tài)變化等特征，幫助人們了解這些特征與基因表達(dá)調(diào)控之間的關(guān)系，加深人們在基因組層面對細(xì)胞生命活動的認(rèn)識。在醫(yī)療領(lǐng)域，活細(xì)胞DNA成像可以用來檢測細(xì)胞內(nèi)基因組DNA的拷貝數(shù)，有助于21-三體綜合征等染色體異常相關(guān)疾病的診斷。
日前，中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心研究員陳玲玲團(tuán)隊開發(fā)了一種活細(xì)胞DNA成像新工具。團(tuán)隊篩選并優(yōu)化了現(xiàn)有的基因編輯系統(tǒng)CRISPR-dCas12a，并基于此構(gòu)建了新型DNA成像系統(tǒng)CRISPRdelight。這一新工具可用于活細(xì)胞內(nèi)非重復(fù)DNA序列成像，為研究活細(xì)胞中DNA位點的空間位置和動力學(xué)特征提供了更加簡單便利的手段。相關(guān)研究論文在線發(fā)表于《自然·方法》雜志。
已有工具存在明顯局限
隨著能夠特異性靶向任意核酸序列的基因編輯系統(tǒng)CRISPR-Cas被開發(fā)出來，基于該系統(tǒng)的活細(xì)胞DNA成像工具也在不斷迭代更新。
“當(dāng)前，活細(xì)胞DNA成像工具的種類已經(jīng)十分豐富。”論文第一作者、中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心博士楊良中介紹，其中大部分工具都是從CRISPR/dCas9-EGFP（EGPF是一種熒光蛋白質(zhì)）系統(tǒng)衍生而來。這些已有的活細(xì)胞DNA成像工具分別從向?qū)NA的骨架結(jié)構(gòu)和表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建方式等方面，對原始系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化升級。
例如上海科技大學(xué)研究員馬涵慧開發(fā)了DNA成像系統(tǒng)CRISPRainbow和CRISPR-Sirius，用于在活細(xì)胞中觀察基因組的三維結(jié)構(gòu)，并示蹤它們的動態(tài)變化。前者創(chuàng)造性地在向?qū)NA骨架結(jié)構(gòu)中引入了RNA適配體，用于標(biāo)記DNA序列，并通過改變RNA適配體的類別，實現(xiàn)了不同DNA靶點的多色成像。后者則在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步做了優(yōu)化，通過增加RNA適配體的數(shù)目來提高成像質(zhì)量。北京大學(xué)教授陳匡時團(tuán)隊開發(fā)的兩種DNA成像系統(tǒng)，則通過引入分子信標(biāo)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像方法來提高DNA成像信噪比，以提升成像清晰度。
“目前較為成熟的系統(tǒng)已經(jīng)實現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)絕大部分重復(fù)DNA序列成像和多色成像，甚至在一定程度上實現(xiàn)了非重復(fù)DNA序列成像，但它們都存在明顯的局限性。”楊良中舉例說，比如一些系統(tǒng)，通過改進(jìn)向?qū)NA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方式，將多條向?qū)NA表達(dá)元件放到同一個質(zhì)粒上，從而減少需要向細(xì)胞內(nèi)遞送質(zhì)粒的數(shù)目，增強(qiáng)成像效果。但將多個表達(dá)元件構(gòu)建到一個質(zhì)粒的方法步驟繁多、操作復(fù)雜，并不利于推廣使用。還有一些系統(tǒng)，通過將DNA的標(biāo)記信號放大，實現(xiàn)一條向?qū)NA對目的序列的標(biāo)記和成像。但僅利用一條向?qū)NA可能會存在標(biāo)記脫靶的問題。
總而言之，在基于CRISPR/dCas9-EGFP的活細(xì)胞DNA成像工具中，利用一條向?qū)NA標(biāo)記DNA往往信號太弱或容易脫靶，要實現(xiàn)特異性非重復(fù)DNA序列成像或多色成像，需要表達(dá)多條向?qū)NA，通過多個靶點DNA信號的富集作用，才能實現(xiàn)對目的非重復(fù)序列成像。而如果讓每個表達(dá)元件只表達(dá)一條向?qū)NA，就會增加向?qū)NA表達(dá)元件的數(shù)量，提高成像的復(fù)雜度，降低成像效率。“如何高效率、高質(zhì)量實現(xiàn)非重復(fù)DNA序列成像，一直是活細(xì)胞DNA成像領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。” 楊良中說。
新型系統(tǒng)更加簡便高效
與基于CRISPR/dCas9-EGFP的活細(xì)胞DNA成像工具不同，此次團(tuán)隊開發(fā)的新工具是基于基因編輯系統(tǒng)CRISPR-dCas12a。這兩種系統(tǒng)都可以特異性靶向DNA，但CRISPR-dCas12a還能夠加工處理系統(tǒng)本身的CRISPR陣列，并生成成熟的向?qū)NA。
“我們開發(fā)的新型DNA成像系統(tǒng)CRISPRdelight正是利用了這一特點，通過表達(dá)一條能編碼多條向?qū)NA的轉(zhuǎn)錄本（即CRISPR陣列）來進(jìn)行成像，而非單獨(dú)轉(zhuǎn)錄每條向?qū)NA。”楊良中介紹，這樣既實現(xiàn)了對靶點DNA信號的富集放大，又避免了系統(tǒng)復(fù)雜度增加。而且這一條轉(zhuǎn)錄本不僅可以編碼靶向同一DNA位點的向?qū)NA，也可以同時編碼靶向不同位點的向?qū)NA，實現(xiàn)多位點多色成像。因此，新系統(tǒng)更加簡便高效，容易通過增加向?qū)NA的數(shù)目提高成像質(zhì)量，大大降低了活細(xì)胞中非重復(fù)序列DNA成像的門檻。
與此同時，團(tuán)隊利用新系統(tǒng)揭示了基因位點在細(xì)胞核內(nèi)的定位與其運(yùn)動能力和轉(zhuǎn)錄活性的相關(guān)性，還實現(xiàn)了對4種活細(xì)胞內(nèi)衛(wèi)星DNA的多位點多色成像。
由于新系統(tǒng)具有簡便易操作等特點，楊良中認(rèn)為，該系統(tǒng)未來有望應(yīng)用于需要進(jìn)行活細(xì)胞DNA成像的實驗室，為活細(xì)胞中基因組DNA轉(zhuǎn)錄活性、DNA在細(xì)胞核內(nèi)的定位分布和動態(tài)變化特征之間的關(guān)聯(lián)性，以及等位基因之間表達(dá)調(diào)控的異質(zhì)性等研究提供助力，還能進(jìn)一步幫助研究人員了解三維基因組在細(xì)胞核內(nèi)高度組織化的分子機(jī)制及其功能意義等。
非重復(fù)DNA序列成像和多位點多色成像是活細(xì)胞DNA成像長期面臨的兩大難題。如今，新系統(tǒng)的出現(xiàn)基本解決了非重復(fù)DNA序列成像的問題，但在活細(xì)胞DNA多位點多色成像方面，新系統(tǒng)仍有改進(jìn)空間。“盡管我們通過在新系統(tǒng)中引入RNA適配體實現(xiàn)了多個重復(fù)DNA序列的多位點多色成像，但是RNA適配體的引入在一定程度上影響了系統(tǒng)對CRISPR陣列的加工能力。”楊良中說，要實現(xiàn)多個非重復(fù)DNA序列的標(biāo)記追蹤，未來還需進(jìn)一步對CRISPRdelight進(jìn)行優(yōu)化。
本文鏈接：新工具破解活細(xì)胞非重復(fù)DNA序列成像難題http://www.sq15.cn/show-2-7864-0.html
聲明：本網(wǎng)站為非營利性網(wǎng)站，本網(wǎng)頁內(nèi)容由互聯(lián)網(wǎng)博主自發(fā)貢獻(xiàn)，不代表本站觀點，本站不承擔(dān)任何法律責(zé)任。天上不會到餡餅，請大家謹(jǐn)防詐騙！若有侵權(quán)等問題請及時與本網(wǎng)聯(lián)系，我們將在第一時間刪除處理。
上一篇： 小菜蛾抗藥性分子機(jī)制揭示
下一篇： 定量合成生物學(xué)有了新范式